Determinarea metodei glucoza-oxidaza

Determinarea concentrației de glucoză din sânge - unul dintre studii biochimice mai frecvent efectuate in laboratoare.

Metoda glucoz oxidaza pentru determinarea glucozei în sânge și urină Pe baza reacției de oxidare a glucozei în prezența glucoză oxidazei enzimă pentru a forma peroxid de hidrogen, care, la rândul său, în prezența peroxidazei oxidează ortotolidin pentru a forma produse colorate; promisiunii concentrației de glucoză de numărul de produse colorate.

Deoarece metoda oxidazei glucozei urmărește identificarea exact glucoza, nu toate tipurile de zaharuri, este utilizat în diagnosticul diferențial al următoarelor boli:

Principiul metodei de determinare a glucozei glucoza-oxidaza

Glucoza în prezența oxidaza glucoza enzima oxidează oxigen atmosferic Xia pentru a forma în timpul reacției de peroxid de hidrogen. peroxid de hidrogen în prezența enzimei peroxidazei oxidează ortotoluidin formă colorată conectează-TION, dintre care intensitatea culorii este proporțională cu Niju conținând glucoză. Această metodă face posibilă determinarea nivelului de glucoză în plasma sanguină, ser și lichidul cerebrospinal.

- natschesertse plasmă

• nou-născut - 1.7-4.2
• copiii de la 6 săptămâni la 15 ani - 3.3 - 5.4
• adulți (bărbați, femei) - 3.9 - 5.6

- natschesertse ser

• nou-născut - 2,6 - 4,2
• copii de la 6 săptămâni până la 2 ani - 3.3 - 5.4
• adulți (bărbați, femei) - 3.9 - 5.6

Reactivii necesari pentru determinarea glucozei prin glucoza-oxidaza

1. Clorură de sodiu 9 g / l (soluția izotonică) a fost preparată prin întindere-voryaya 0,9 g NaCl în 100 ml apă.

2. Zinc sulfat 50 g / l 5 g de sulfat de zinc soluție (ZnSO4) a fost dizolvată în apă, volumul a fost ajustat la 100 ml.

3. Hidroxid de sodiu, 0,3 mol / l: preparată prin dizolvarea a 1,2 g de NaOH în 100 ml de apă, concentrația este verificată prin titrare (trebuie sa fie 0,3N).

4. Ortotoluidin 1% soluție: 1 g produs se dizolvă în 100 ml alcool absolut. Soluția poate fi stocată în frigidere-nick într-o sticlă cu dop de sticlă câteva luni. Au pregătire comercial-schiysya poate fi purificat prin recristalizare, pentru care a fost dizolvat în etanol absolut, se adaugă apă, iar cristalele precipitate au fost colectate prin filtrare prin aspirație și apoi se usucă pe clorură de calciu.

5. tampon acetat pH 4,8: ​​Se amestecă 4 părți acid acetic 0,25 N (verifica titrare) și 6 părți de acetat de sodiu 0,25 N (conținând 34 g de CH3COONa X ZN2O în 1 litru).

6. Glucoza - uscat activitatea de droguri 3000 U / mg sau mai mare.

7. peroxidază de hrean. 1 mg dizolvat în 5 ml de tampon acetat, pot fi depozitate în frigider ca un non-zile.

8. Reactiv de lucru: 80 ml de tampon de acetat se dizolvă 2 mg de glucoză oxidază și 1 mg de peroxidazei, s-a adăugat 1 ml de soluție ortotoluidina 1%, se agită și volumul a fost ajustat cu tampon până la 100 ml. Reactiv de lucru ar trebui să fie transparente, incolore sau au o tentă ușor verde, în acest caz, este stabilă atunci când este depozitat în frig. În cazul în care intensitatea culorii sau câteva ore după-Nachi NAET pentru a precipita, ceea ce înseamnă că ortotoluidin insuficientă, dar curat, și trebuie să fie recristalizată de gătit.

9. soluții de glucoză de calibrare. Glucoza preliminar uscate, dar la o temperatură de 37 ° C și se depozitează într-un exicator. În primul rând, o soluție stoc având o concentrație de 50 mmol / l până la 180 mg de material care a fost dizolvat în 20 ml de sol-Pa saturat (aproximativ 0,3% concentrație) benzoic. Din această soluție soluțiile de calibrare de lucru sunt preparate conținând 3; 6; 9; 12; 15; 18 și 21 mmol / l, care ia 0,6; 1.2; 1.8; 2.4; 3; 3,6 și 4,2 ml din soluția stoc a fost ajustat cu o soluție saturată de acid benzoic la un volum de 10 ml. Aceste soluții conțin glucoză la aceeași concentrație în care este în sânge, ceea ce facilitează calculele de calibrare.

Progresul în determinarea metodei glucoza-oxidaza

Tubul de centrifugare este realizată din 1,1 ml de soluție de clorură de sodiu, 0,4 ml dintr-o soluție de sulfat de zinc și 0,4 ml soluție de NaOH 0,3N, agitată; în care gelul este format oxid foarte subțire de zinc-ghid rata, eliberat 0,1 ml de sânge sau de soluție gauge TION se agită din nou și după 10 minute, centrifugă de viteză ruyut la 3000 rot. / min timp de 10 minute.

La 1 ml de supernatant se adaugă 3 ml de lucru-tive și rea agitat ușor.

Treptat colorarea începe să se dezvolte, care la temperatura normală a camerei atinge un maxim după 13-15 minute, iar apoi se micșora treptat-cute. Fotometric întotdeauna în aceeași perioadă de timp după adăugarea reactivului de lucru într-o cuvă cu o lungime optică cale de 1 cm, cu un filtru roșu (lungimea de undă de 625 nm), față de un martor care da simultan cu testele de lucru, dar în schimb sângele ia soluție fiziologică de clorură de sodiu.

La prepararea GRA calibrare-fic în loc să ia probe de sânge de 0,1 ml din soluția de calibrare corespunzătoare.

Calcularea nivelului de glucoză poate fi efectuată de proporțiile regulă sau calendarul cal-rovochnomu pentru construirea a cărui concentrație axă-none dyval glucoză (mmol / l), iar pe de altă parte - măreție bine extincției.

Note la metoda de determinare a metodei glucoza-oxidaza

1. Este posibil mai întâi să elibereze sângele din pipetă cer în soluție izotonică de clorură de sodiu. și apoi se adaugă o soluție care sulfa de zinc și NaOH.

2. Atunci când munca sistematică nu este necesară construirea în mod continuu o curbă de calibrare în toate punctele, este suficient de procesare-Arici fluorescent probă-martor și 2-3 puncte în intervalul 3-9 mmol / l, iar curba de calibrare deplină construi numai la schimbarea reactivilor sau forjare tehnici.